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现代中药分析实验讲义2015版
2017-05-17 16:48   审核人:

天津中医药大学

《现代中药分析》实验讲义

中药学院 分析化学教研室编

2015年4月5日

所属课程

现代中药分析 核心课程

学时

36

适用专业

中药学1004中药制药1005

课程英文名称

Analysis of Chinese Medicinal Preparation Experiment

一、实验课程简介

《中药制剂分析》是一门以中医药理论为指导,运用现代分析理论和方法研究中药制剂质量的综合应用性学科,是中药专业的核心主干课程之一。

二、实验课程目标

通过实验,加深对中药制剂分析基本理论、基本知识的理解,正确、熟练地掌握中药制剂分析常用的法定方法及规范化的操作技能。

《现代中药分析实验》是《化学分析》、《仪器分析》、《中药学》、《方剂学》、《中药炮制》、《中药鉴定学》、《中药化学》和《中药制剂学》等相结合的一门具有很强实践性和综合性的应用科学。本课程实践教学既注重基本技能训练、又加强创新能力的培养。在实践教学内容的安排上,既有验证性实验,让学生掌握药物分析的一般方法与技术特点;又有综合性试验,使学生将理论知识和具体的药物分析测定技术融会贯通,掌握解决实际药物分析技术问题的方法;还包括设计性试验,培养学生的研究创新能力。验证性、综合性和设计性试验分步骤逐步实施,使学生的理论和实验技能得到不断的进步。

三、实验项目

(一)实验项目一:加味香连丸的TLC鉴别

1、实验项目学时:6学时

2、实验项目类型:验证性、综合性实验。

3、实验项目内容:1.加味香连丸中黄连总碱的提取;黄连药味的薄层鉴别。

2.加味香连丸中挥发油的提取;药味的薄层鉴别。

4、实验项目学习要求:(从运用知识、提高能力两个层次说明学习要求)

(1)运用知识:中药材及其复方制剂的TLC鉴别、中药有效部位的提取、对照液、供

试液制备。TLC基本操作技能练习。

(2)提高能力:掌握中药提取、净化操作;5种TLC溶液配制操作;TLC规范操作;

鉴别中药真伪操作技能。提高TLC法鉴别中药的能力及有效部位提取能力。

5、主要仪器设备与材料:

千分之一天平、恒温水浴锅、层析缸、三用紫外分析仪、喷雾瓶、吹风机、

加味香连丸、盐酸小檗碱对照品、黄连及木香对照药材,95%乙醇(AR)。

6、与理论课程的关系:本实验是在第二章鉴别基础知识教学基础上的实验教学。是中药

鉴别主要方法的直接应用。是中国药典的最主要方法。

7、实验步骤

1)取本品60mg,研细,加乙醇5ml,置水浴中加热回流15分钟,滤过,滤液补加乙醇使成5ml,作为供试品溶液。另取黄连对照药材50mg,同法制成对照药材溶液。再取盐酸小檗碱对照品,加乙醇制成每1ml含0.04mg的溶液。照薄层色谱法试验,吸取上述三种溶液各2微升,分别点于同一硅胶G薄层板上,以乙酸乙酯:氯仿:甲醇:氨水:二乙胺(8:2:2:1:0.5)为展开剂,展开,取出,晾干,置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同的黄色荧光斑点;在与对照品色谱相应的位置上,显相同的一个黄色荧光斑点。

2)取本品0.5g,研细,加乙醚5ml,放置2小时,时时振摇,滤过,滤液挥去乙醚,残渣加醋酸乙酯0.5ml使溶解,作为供试品溶液。另取木香对照药材0.2g,加乙醚5ml,同法制成对照药材溶液,照薄层色谱法试验,吸取上述两种溶液各2微升,分别点于同一硅胶G薄层板上,以环己烷:丙酮(10:3)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以5%香草醛硫酸溶液,在105℃烘约5分钟。供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同的紫红色至蓝紫色斑点。

8、数据处理:给出鉴定结论

如实记录,画出薄层板(黄连及木香)

9、思考题:

1定性鉴别需配置哪几种溶液?为什么?

2定性鉴别对量有哪些要求?

(二)实验项目二:紫外分光光度法测定加味香连丸中黄连生物碱的含量

1、实验项目学时:6学时

2、实验项目类型:验证性、综合性实验。

3、实验项目内容:1.利用氧化铝色谱柱净化加味香连丸中黄连生物碱

2.利用紫外紫外分光光度法测定黄连总生物碱含量

4、实验项目学习要求:(从运用知识、提高能力两个层次说明学习要求)

(1)运用知识:掌握用柱层析净化提取物的方法;掌握紫外分光光度法测定复方中某一类物质的方法。

(2)提高能力:掌握中药提取、净化操作;UV-VIS规范操作;提高UV-VIS法测定中药成分含量的能力。

5、主要仪器设备与材料:

1.紫外-可见分光光度计 2.小层析柱:高13 cm,内径8 mm,2个

3.中性Al2O3(150—200目) 4.样品:加味香连丸

5.对照品:盐酸小檗碱

6、与理论课程的关系:本实验是在第四单元含量测定基础知识教学基础上的实验教学。是UV-VIS法测定中药成分含量方法的直接应用。是中国药典的主要方法。

7、实验步骤

1含量测定:

A、样品溶液配制:

取加味香连丸0.5g,研成细粉,精密称取0.1g(实验中称取多少写多少),置60ml索氏提取器中加95%乙醇40ml连续回流提取生物碱至无色。将提取液浓缩至20ml,定量转移到25ml容量瓶中,用95%乙醇至刻度.

精密吸取样品液1.0ml通过Al2O3柱,用95%EtOH至洗脱完全,收集洗脱液于10ml容量瓶中,连续加95%乙醇至刻度,于λmax350nm处测定吸收度。

B、对照品溶液配制

用95%乙醇溶液,配制对照品溶液浓度为0.006mg/ml。

C、含量测定

应用外标一点法测定加味香连丸中总生物碱的含量。

8、数据处理

计算出100g加味香连丸中含有盐酸小檗碱多少克?

9、思考题

1如何判断生物碱已被提取完全?

2以测定小檗碱为例,除此方法外还有什么测定复方中黄连生物碱的方法?

3本实验中测定样品紫外吸收度时,以什么作为空白对照液?为什么?

(三)实验项目三:复方丹参滴丸中龙脑的含量测定

1、实验项目学时:6学时

2、实验项目类型:验证性、综合性实验。

3、实验项目内容:1.色谱条件的选择;

2.实验用溶液的配制,包括内标溶液、对照溶液及样品溶液的配制;

3.利用内标法测定复方丹参滴丸中龙脑的含量。

4、实验项目学习要求:(从运用知识、提高能力两个层次说明学习要求)

(1)运用知识:掌握气相色谱法测定中药制剂中成分含量的方法和原理;熟悉气相色谱仪进行含量测定的操作过程。熟悉气相色谱仪各种操作条件的选择应用。

(2)提高能力:GC的基本操作、仪器条件确定;提高运用GC进行药物含量测定的能力。 5、主要仪器设备与材料:

1.安捷伦-6820气相色谱仪(FID检测器)、微量进样器;

2.SPB-5毛细管色谱柱(弱极性)

3.水杨酸甲酯(内标)、醋酸乙酯(AR)

4.龙脑对照品(中国药品生物制品检定所)

5.复方丹参滴丸(天士力有限公司生产)。

6、与理论课程的关系:本实验是在第四单元有关气相色谱法教学基础上的实验教学。是中药含量测定重要方法的直接应用。是中国药典的主要方法。

7、操作步骤

1.色谱条件

采用SPB-5毛细管色谱柱(弱极性),柱长30m,内径0.32mm,液膜厚度0.25μm,分流进样1μL(分流比1:20);柱温:初始温度100℃,保持1min,以8℃/ min升至180℃,保持1min;后进样口温度为220℃;前检测器温度为300℃;载气为N2,柱前压100kPa左右;H250kPa;空气50kPa;FID检测器。理论塔板数按龙脑峰计算不低于十万;RS>1.5;对称性因子T=0.95。

2.校正因子测定

内标溶液配制 取水杨酸甲酯125mg,置25mL量瓶中,加醋酸乙酯至刻度,制成每lmL含5mg的内标溶液。

对照溶液配制 取龙脑对照品5mg,精密称定,置10mL量瓶中,加内标溶液至刻度,摇匀,作为龙脑对照溶液。

测定校正因子 取龙脑对照液1μL注入气相色谱仪,测定至少5次,计算校正因子。

3.测定法

取合成冰片5mg,精密称定,置10mL量瓶中,加入内标溶液使冰片溶解并稀释至刻度,摇匀,吸取2μL,注入气相色谱仪,测定。按内标法计算含量。

8、注意事项

1实验前,必须对气相色谱仪整个气路系统进行检漏。如有漏气,及时处理。

2开机前先通气,实验结束,先降温、关机,后关气。

3由于样品中挥发性成分较多,样品干燥时,要注意方法和温度。

9、思考题

1在建立一个中药制剂的测定方法时,如何进行方法学考察?

2研究和设计中药制剂的分析方法时,应根据哪几方面内容?

(四)实验项目四:中药制剂中橙皮苷的含量测定

1、实验项目学时:6学时

2、实验项目类型:验证性、综合性实验。

3、实验项目内容:1.HPLC仪器使用及基本操作;

2.色谱条件的选择;

3.实验用溶液的配制,包括橙皮苷对照品溶液及供试品溶液的制备;

4.利用外标一点法进行定量分析。

4、实验项目学习要求:(从运用知识、提高能力两个层次说明学习要求)

(1)运用知识:HPLC的具体应用。掌握高效液相色谱仪的的基本操作及定量方法;

(2)提高能力:提高HPLC的基础操作能力、仪器条件选择能力;提高运用HPLC进行药物定量分析能力。

5、主要仪器设备与材料:

1.高效液相色谱仪(紫外检测器)

2.C18反相色谱柱(Hypersil ODS 5µm×4.6 mm×250 mm);

3.微量进样器

4.一次性注射器

5.0.45µm微孔滤膜

6.容量瓶50、250 ml

7.移液管,洗耳球;具塞三角瓶(50 ml);超声波清洗器;天平;滤纸、培养皿;炮弹管。

8.橙皮苷对照(中国药品生物制品检定所)

9.陈皮(天津市饮片厂)

6、与理论课程的关系::本实验是在第四单元有关高效液相色谱法教学基础上的实验教学。是中药含量测定重要方法的直接应用。是中国药典的主要方法。

7、操作步骤

1)色谱条件:

色谱柱:C18,250×4.6mm,5μm;流动相:43%甲醇;柱温:室温;流速:1ml/min;检测:UVD,波长为270nm;进样量:10μL。理论塔板数n>3000。

2)橙皮苷对照品溶液的制备及测定:

取橙皮苷对照品1.6mg,加甲醇置100ml容量瓶中,制成0.016mg/ml的溶液,作为对照品溶液。精密吸取10μL按上述色谱条件进样,测定对照品峰面积。

3)供试品溶液的制备:

取中药复方,精密称取0.3g置锥形瓶中,加入甲醇50ml,加塞称重,超声提取15分钟后继续称重并用甲醇补足减少的重量。用0.45μm微孔滤膜过滤,取续滤液,作为供试品溶液。

4)测定

精密吸取10μL供试品溶液,注入液相色谱仪,测定供试品中橙皮苷峰面积。

5)计算

外标一点法计算100克中药复方中含有橙皮苷的克数(%)。

(五)实验项目五:HPLC综合实验—一清颗粒测定

1、实验项目学时:6学时

2、实验项目类型:综合性实验。

3、实验项目内容:1.实际运用HPLC仪器,解决实际问题

2.一清颗粒中黄芩苷的含量测定

4、实验项目学习要求:(从运用知识、提高能力两个层次说明学习要求)

(1)运用知识:现代中药分析的特点以及一般程序,掌握中药分析方法学考察的基本内容。

(2)提高能力:提高运用HPLC进行药物定量分析能力。

5、主要仪器设备与材料:

1.高效液相色谱仪(紫外检测器)

2.C18反相色谱柱(Hypersil ODS 5µm×4.6 mm×250 mm);

3.微量进样器

4.一次性注射器

5.0.45µm微孔滤膜

6.容量瓶50、250 ml

7.移液管,洗耳球;具塞三角瓶(50 ml);超声波清洗器;天平;滤纸、培养皿;炮弹管。

8.对照品(中国药品生物制品检定所)

9.一清颗粒(自制)

6、与理论课程的关系:本实验是在第四单元有关高效液相色谱法教学基础上的实验教学。是中药含量测定重要方法的直接应用。是中国药典的主要方法。

7、实验步骤

1色谱条件与系统适用性试验

色谱柱:Hypersil ODS(4.6 × 250 mm,5 µm)

流动相:甲醇-1%冰醋酸水溶液(52:48,v/v)或(54:46,v/v)

检测波长:280 nm

流速:1 ml/min

柱温:室温

进样量:5 μl

按黄芩苷计算理论塔板数不低于3000

2黄芩苷对照品溶液的制备

精密称取在105℃干燥至恒重的黄芩苷对照品适量,用75%乙醇配制成浓度为20.5 µg/ml的黄芩苷对照品溶液,于4°C保存,备用。

3供试品溶液的制备

取装量差异项下的内容物,研细,取约0.1 g,精密称定,置50 ml量瓶中,加70%乙醇10 ml,超声处理20分钟,用70%乙醇稀释至刻度,摇匀,上清液用0.45 µm微孔滤膜过滤,取续滤液,即得。

4阴性溶液的制备

取不含黄芩的药材粉末照供试品溶液同法制备。

5测定法

分别吸取阴性溶液、对照品溶液与供试品溶液各5 µL注入液相色谱仪,测定,即得。

本品每袋(7.5 g)含黄芩以黄芩苷(C21H18O11)计不得少于30.0 mg。

8、黄芩苷含量测定的方法学考察

8.1线性关系考察

本实验采用外标一点法,不做线性考察。

8.2精密度试验

取同一对照品溶液5 μl注入高效液相色谱仪,连续进样6次,考察仪器精密度。

Table 8.1 The results of precision test

测定次数

保留时间(tR

峰面积(A)

峰面积平均值

RSD

1

2

3

4

5

6

8.3重复性试验

取同一批号的一清颗粒供试品,按照3.3项下供试品溶液的配制方法,平行制备6份供试品溶液,各取5 μl,注入高效液相色谱仪,进样分析,考察方法的精密度。

Table 8.2 The results of reproducibility test of Baicalin

样品号

W称重

(g)

峰面积

(A)

黄芩苷含量

(mg/7.5g)

含量平均值(mg/7.5g)

RSD

(%)

1

2

3

4

5

6

8.4专属性试验

阴性溶液进样分析,与对照品溶液和供试品溶液色谱图对比,考察方法专属性。

8.5稳定性试验

取同一份供试品溶液,分别于样品制备后0、2、4、6、12及24 h进样分析(依试验时间而定),考察方法稳定性。

8.6加样回收试验

精密称取已知含量的供试品6份(依试验时间而定),按黄芩苷已知量的1倍加入对照品,与3.3项同法制备供试品溶液,在上述色谱条件下进样分析,计算加样回收率。(依试验时间而定)

9、一清颗粒中黄芩苷的含量测定(可用重复性试验结果)

取同一批号的一清颗粒供试品,按照3项下供试品溶液的配制方法,平行制备3份以上样品,计算每袋(7.5 g)中黄芩苷的含量(mg)。

(本次试验使用重复性试验结果计算一清颗粒中黄芩苷的含量)

含量测定结果计算公式:

CX= CR*AX*D*7.5*/(AR*W称重*1000)

CX:mg/袋(7.5 g)

CR:对照品溶液浓度(µg/ml)

AR:对照品溶液黄芩苷峰面积

AX:供试品溶液黄芩苷峰面积

D:供试品溶液体积(本次试验为50 ml)

W称重:供试品实际称重量

(六)实验项目六:HPLC综合实验—一清颗粒测定

1、实验项目学时:6学时

2、实验项目类型:综合性实验。

3、实验项目内容:1.实际运用HPLC仪器,解决实际问题

2.一清颗粒中黄芩苷的含量测定

4、实验项目学习要求:(从运用知识、提高能力两个层次说明学习要求)

(1)运用知识:现代中药分析的特点以及一般程序,掌握中药分析方法学考察的基本内容。

(2)提高能力:提高运用HPLC进行药物定量分析能力。

5、主要仪器设备与材料:

1.高效液相色谱仪(紫外检测器)

2.C18反相色谱柱(Hypersil ODS 5µm×4.6 mm×250 mm);

3.微量进样器

4.一次性注射器

5.0.45µm微孔滤膜

6.容量瓶50、250 ml

7.移液管,洗耳球;具塞三角瓶(50 ml);超声波清洗器;天平;滤纸、培养皿;炮弹管。

8.对照品(中国药品生物制品检定所)

9.一清颗粒(自制)

6、与理论课程的关系:本实验是在第四单元有关高效液相色谱法教学基础上的实验教学。是中药含量测定重要方法的直接应用。是中国药典的主要方法。

实验步骤及结果计算同实验项目五。

四、实验考核

(一)实验考核项目和比例:实验考核成绩由每次试验的预习报告、实验操作、实验报告完成情况、次数及其质量确定;实验缺勤1/3,实验成绩以零分记并取消参加考试资格。

(二)考核项目评分依据:

序号

项目

成绩

说明

1

课前预习

10%

实验前必须写出报告并查考实验中涉及的基本内容、操及操作注意事项,经教师检查,方可参加实验。

2

实验操作

20%

3

原始数据

5%

指导老师签字

4

实验报告

20%

要求独立完成报告,若发现抄袭,均按不及格处理。

5

数据处理

10%

独立完成数据处理、绘图等。

6

现象观察与讨论

25%

对实验中观察到的现象做必要的分析、讨论、得出结论。

7

思考题

10%

要求完成实验后的思考题。

(三)实验考核结果反馈:①反馈实验考核项目学生成绩;反馈学生操作、讨论、实验报告的质量以及提高建议。

张玉萍 2015.8.8

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